ELECTROFORESIS DE DNA Y PROTEÍNAS
 
   
Introducción introduccion
Objetivo General objetivos
Materiales, Reactivos y Procedimiento reactivos
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(http://gslc.genetic.utah.edu)

INTRODUCCIÓN top


Electroforesis es la migración de las moléculas cargadas presentes en una solución acuosa como respuesta a la presencia de un campo eléctrico, dichas moléculas son atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Dos fuerzas de acción opuesta determinan la velocidad de la partícula en cuestión. Por un lado, la fuerza eléctrica, que la atrae al electrodo, cuya intensidad es directamente proporcional a la carga, y, de acuerdo a la segunda ley de Newton (F=m x a, entonces a=F/m), le impone una aceleración directamente proporcional al cociente carga/masa (q/m). Por otro lado, la fuerza de rozamiento, que se opone a la migración con una intensidad que depende del tamaño y la forma de la partícula y de las características del medio (viscosidad y estructura, por ejemplo).

La electroforesis se utiliza en el laboratorio para separar macromoléculas en solución, en forma analítica (es decir, sólo para verlas) o preparativa (para purificarlas). Los ácidos nucleicos tienen un fosfato cargado negativamente por nucleótido. Como el peso molecular de los cuatro nucleótidos es similar, la relación q/m es independiente de la secuencia y el tamaño de la molécula. Por lo tanto la aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es igual para cualquier molécula de ácido nucleico. La única diferencia en velocidad de migración estará dada por diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea de su forma y de su tamaño.

En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier molécula, entonces las distintas moléculas tendrán una velocidad que sólo dependerá de su tamaño, es decir, de su longitud en pares de bases. Sin embargo, si tratáramos de separar moléculas de DNA doble cadena en una electroforesis en una solución acuosa, nos encontraríamos con que el rozamiento impuesto por ésta es tan pequeño que todas las moléculas migrarían juntas. Además, durante la electroforesis, las moléculas se separarían unas de otras por difusión, impidiendo el análisis. Para lograr una separación eficiente, se utiliza un medio soporte que aumente considerablemente la fricción recibida por las macromoléculas y reduzca la difusión a un mínimo.

Este medio suele ser una red molecular de algún polímero orgánico, conocida como gel, por su consistencia gelatinosa. Los más utilizados en laboratorios de biología molecular son de poliacrilamida, una red molecular estabilizada por uniones covalentes, y agarosa (un derivado del agar-agar), un polisacárido extraído de un alga que forma, al disolverlo, una red estabilizada por interacciones no covalentes. Las mezclas de DNAs de distinto tamaño se hacen migrar (desplazarse) a través del gel durante un cierto tiempo y se obtiene una separación en la que la distancia migrada por una molécula dada es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular (o de su longitud en pares de bases). El tamaño de una muestra desconocida puede estimarse corriendo en paralelo muestras de longitud conocida.

Cuando se hace un análisis electroforético de muestras de ácidos nucleicos que no poseen todos la misma forma, debido, por ejemplo, a la presencia de estructuras secundarias que dependen del apareamiento interno, o sea, de la secuencia (RNA o DNA simple cadena), es necesario, para determinar su peso molecular, homogeneizar su estructura. Para ello se utilizan agentes desnaturalizantes fuertes que destruyan la estructura secundaria, por ejemplo urea, formamida, formaldehído o pH básico (para DNA).

En el caso de las proteínas el problema es más complejo porque no sólo distintas moléculas de igual tamaño (peso molecular) tienen formas distintas sino que además la carga (y con ella el q/m) varía mucho de una a otra, además, como son compuestos anfotéricos, su carga neta está determinada por el pH del medio en que se encuentren, en una solución con un pH superior a su punto isoeléctrico estarán cargadas negativamente y en un campo eléctrico migrarán hacia el ánodo(+) pero si el pH del medio es inferior a su punto isoeléctrico, migrarán hacia el cátodo(-).

Para igualar la relación q/m y la forma de todas ellas se utiliza un detergente cargado negativamente, el dodecil sulfato de sodio (SDS), que las desnaturaliza y las recubre en cantidad proporcional al tamaño, proveyéndoles un gran número de cargas que hacen que las propias sean despreciables y que el q/m de todas las moléculas se equipare. El SDS envuelve al polipéptido en una relación de masas 1,4:1 y el polipéptido queda cargado negativamente con una carga proporcional a su longitud.

Usualmente es necesario reducir los puentes de disulfuro de las proteínas para permitir la unión cuantitativa del SDS, esta reducción se lleva a cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. Sólo en estas condiciones es posible determinar el tamaño de un polipéptido en un gel, en el que tendrá una migración inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular.

OBJETIVO GENERAL top

Preparar, realizar una electroforesis de DNA en gel de agarosa y otra de proteínas en gel de poliacrilamida e interpretar los resultados.

MATERIALES, REACTIVOS Y PROCEDIMIENTO top

Reactivos para electroforesis de DNA en gel de agarosa:

Buffer Tris-borato (TBE) pH 8.0 sln 5x: Preparación: Disolver 54g de Tris base, 27,5g de ácido bórico, 20mL de una solución de EDTA 0.5M ajustar pH y ajustar volumen a 1L, guardar en frasco ámbar bajo refrigeración.

Preparación del molde para preparar un gel horizontal: Sobre una placa de vidrio limpia y desengrasada de tamaño adecuado haga un marco con cinta de enmascarar para que quede con una profundidad de mínimo 7mm teniendo la precaución de que quede bien sellado.

Preparación del gel de agarosa: Preparar una solución de agarosa al 0.8% en buffer TBE. Agregar la cantidad adecuada de agarosa en polvo al volumen de buffer TBE medido, calentar hasta que la agarosa se disuelva (quede translúcida la solución). Verter la solución en caliente sobre el molde previamente preparado y colocar la peineta sin traspasar el gel; es decir, teniendo la precaución que los dientes que formarán los posuelos queden a una distancia de 0,5-1 mm por encima de la base del gel para que los posuelos queden completamente sellados.

Después de que el gel se enfríe y solidifique, retire cuidadosamente la peineta y la cinta de enmascarar con la que hizo el molde del gel y coloque el gel en el tanque de electroforesis.

Agregue suficiente buffer TBE para cubrir el gel 1mm por encima de su parte superior.

Mezcle las muestras de DNA que están suspendidas en TE con buffer de carga (una solución de sacarosa al 40% con azul de bromofenol al 0.25% preparado en agua) en una proporción 1:1.

Coloque lentamente las muestras mezcladas con el buffer de carga en los posuelos dentro del gel de agarosa con la ayuda de una micropipeta.

Complete el montaje teniendo la precaución de que el polo positivo este al lado opuesto del sitio de siembra, aplique la corriente eléctrica (3-5V/cm) hasta que el color haya migrado casi hasta el final del gel (unos 10cm), suspenda la corriente eléctrica, retire el gel y sumérjalo 45 minutos en una solución con bromuro de etidio (en buffer o agua) con una concentración de 0,5 g/mL.

Tenga la precaución de usar guantes cuando manipule el gel o las soluciones ya que el bromuro de etidio es un poderoso mutagénico.

Coloque luego el gel sobre un transiluminador ultravioleta (UV) y observe las bandas de DNA protegiendo los ojos de la radiación UV.

Reactivos para electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida:

Precaución, la acrilamida y bisacrilamida como monómeros son potentes neurotoxicos acumulativos que se absorben rápidamente por la piel, no pipetear con la boca ni manipular las soluciones sin usar guantes.

Buffer Tris-HCl pH 8.9 (solvente para poliacrilamida y persulfato de amonio): Preparación: Disolver 36.6 g de Tris(hydroxymethyl)-aminometano p.a. (V-12) en 850 mL de agua destilada, ajustar pH y ajustar volumen a 1 L, guardar en frasco ámbar bajo refrigeración.

Preparación de los geles:

Gel de corrida (Sln. 1A):

Para 50 mL: 9,2 g de acrilamida, 0,184 g de bisacrilamida y llevar a 50 mL con buffer Tris-HCl, mezclar bien, filtrar y empacar en frasco ámbar bajo refrigeración.

Gel de separación (Sln. 1B):

Para 50 mL: 4,2 g de acrilamida, 0,184 g de bisacrilamida y llevar a 50 mL con buffer Tris-HCl, mezclar bien, filtrar y empacar en frasco ámbar bajo refrigeración

Solución de persulfato (Sln. B):
Para 50 mL: 0,125 g de persulfato de amonio, llevar a 50 mL con buffer Tris-HCl, mezclar bien, no filtrar y empacar en frasco ámbar bajo refrigeración.

Buffer Tris-Borato pH 8.8 (para los tanques):
Para 1 L: 7,86 g de Tris(hydroxymethyl)-aminometano p.a. (V-12), 1.925 g de ácido bórico p.a. (AC-3). Disolver el Tris en 600 mL de agua destilada, agregar el ácido bórico hasta disolverlo completamente, ajustar a volumen de 1L con agua destilada, mezclar bien y guardar bajo refrigeración.

Colorante (Amido Black) (150 mL):
1 g de Amido Black, 15 mL de ácido acético, 67 mL de metanol y 67 mL de agua destilada.

Preparación de los geles de poliacrilamida para electroforesis de proteínas:
Seguir las instrucciones del docente o técnico del laboratorio para ensamblar el montaje.

Gel de corrido:
10 mL de Solución 1A, 10 mL de solución B y 40 ?L de TEMED, mezclar y rápidamente verter entre las placas de vidrio, agregar un poco de agua en la superficie para evitar el contacto con el aire, dejar polimerizar o gelificar.

Gel de separación:
3 mL de solución 1B, 3 mL de solución B y 20 ?L de TEMED, mezclar y rápidamente verter entre las placas de vidrio sobre el gel de corrido habiendo retirado previamente el agua, colocar la peineta del tamaño adecuado para formar los posuelos evitando la formación de burbujas. Dejar polimerizar o gelificar y retirar la peineta con precaución para no dañar el gel, inmediatamente lavar los posuelos con agua.

Preparación de las muestras:
10 ?L de plasma o suero y 10 ?L de una solución de sacarosa al 40% con azul de bromofenol al 0.25%, mezclar.

Terminar de ensamblar el montaje, agregar suficiente buffer Tris-Borato pH 8.8 para cubrir los posuelos. Con la ayuda de una jeringa colocar las muestras en los posuelos, complete el montaje teniendo la precaución de que el polo positivo este al lado opuesto del sitio de siembra, aplique la corriente eléctrica hasta que el color haya migrado casi hasta el final del gel, suspenda la corriente eléctrica, retire el gel y sumérjalo al menos una hora en la solución de colorante Amido Black, luego desteñir el gel sumergiéndolo en una solución de metanol al 20% en agua y acido acético al 10%. Observar las bandas de proteínas de color azul oscuro.

BIBLIOGRAFIA top

Maniatis, T, Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Seventh impression. Cold Spring Harbor Laboratory. pp. 150-185. United States of America, 1982. ISBN: 0-87969-136-0

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López, C. Electroforesis de proteinas del suero humano en gel de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Universidad de Antioquia, departamento de Química, Laboratorio de Cromatografía CNQ-533. 2004. Tomado de: http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/cnq533g.html

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Electroforesis de ácidos nucleicos en gel. Diagramas animados de técnicas y procesos bioquímicos. Complementos de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Alcalá. España. 2004. Tomado de: http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/elfo/electrof_txt.htm

Electroforesis en geles de agarosa. Introducción a la Biología Molecular y Celular. Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular, Universidad de Buenos Aires. Argentina. 2004. Tomado de: http://therion.dna.uba.ar/ibmc/Agarosa.htm

 
 
 
 
     
 
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