CULTIVO DE LINFOCITOS Y OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS
 
   
Introducción introduccion
Objetivos objetivos
Reactivos y materiales reactivos
Procedimiento procedimiento
Obtención de cromosomas cromosomas
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INTRODUCCIÓN top

El cultivo de células animales permite la realización de diferentes actividades docentes que tienen importancia en el ámbito de la biotecnología. Los diferentes tipos celulares animales tienen dos opciones de crecimiento, en suspensión y adheridas, el estudiante deberá conocer los dos sistemas. Para ello deberá realizar cultivos a corto plazo máximo una semana y realizar dos experiencias, la primera la obtención de cromosomas y la segunda la criopreservación.


OBJETIVO GENERAL top

Dar al estudiante las bases del cultivo de células en suspensión (linfocitos) y de células adheridas (línea celular).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtener cromosomas de un cultivo de linfocitos de sangre de diferentes especies.de mamíferos.

Cultivar células adheridas, para establecer cambios morfológicos durante su crecimiento.

Criopreservar células conservando las características morfológicas iniciales

REACTIVOS Y MATERIALES top

Jeringa de 2,5cc, frasco de cultivo ( Boterito), pipeta de 5ml , pipeta de 1 ml, incubadora a 37oC, tubos cónicos de centrífuga, centrífuga, pipetas pasteur, láminas portaobjetos, láminas cubreobjetos, aceite de Inmersión, microscopio de luz (100X), heparina, medio de cultivo RPMI, suero fetal bovino, extracto de frijol, solución hipotónica de KCL 0.075M, colchicina, metanol, ácido acético, colorante de Giemsa

PROCEDIMIENTO top

La muestra que será suministrada a los estudiantes, será tomada en forma estéril de la vena yugular en una jeringa heparinizada (Liquemine, Roche). Estas muestras han de ser identificadas.

La siembra debe hacerse en condiciones estériles y se sembrarán 10 gotas de sangre en 5 ml de medio RPMI (Roswell Park memorial Institute) suplementado con suero fetal bovino al 10% y 100ul de Fitohemaglutinina (50Ugrml). Se lleva el cultivo a una incubadora de 37oC por 72 horas.
OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS v

Se adiciona al cultivo 0,1 ml de Colcemid (5ugr/ml)y se deja en incubacón por 30 minutos, luego se centrifugan 10 minutos a 1800 rpm. Se descarta el sobrenadante y se adicionan 8 ml de solución hipotónica y se homogeniza bien la muestra y se incuba 10 minutos a 37oC , posteriormente se adiciona 1 ml de Carnoy ( Metanol: Acido acético 3.1), se homogeniza y se centrífuga.1800 rpm x 10 minutos. All pellet se le adicionan 10 ml, se homogeniza y se deja por 30 minutos en refrigeración (5oC). Se centriufa por 10 minutos, el pellet se resuspende en 5 ml de fijador y se vuelve a centrifugar, esta operación se repite dos veces mas.

Al final el pellet se resuspende en 0,5 ml de Fijador , finalmente se colocan 2 o 3 gotas de fijador sobre la lámina, esta se deja secar.

Las láminas son coloreadas con colorante de Giemsa y se observan al microscopio las metafases.

Seguimiento:
El cultivo debe revisarse a las 24 horas para evidenciasr signos de contaminación.

Las láminas una vez coloreadas deben revisarse para observar la presencia de metafases y si es posible tomar fotograficas para analizarlas.

GLOSARIO top

Medio de cultivo : Solución de aminoácidos, vitaminas y sales que es capaz de soportar el desarrollo celular

Colchicina: Inhibidor de la despolimerización de los microtúbulos, necesario para detener las células en metafase

Fitohemaglutinina: Mitógeno, utilizado para promover la división de los linfocitos en el cultivo

Cultivo: Procedimiento mediante el cual una suspensión de células son puestas a crecer en condiciones controladas

 
     
 
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